Účinky Azithromycinu a Rifampinu na infekci Chlamydia trachomatis, studie In Vitro

Antimicrob Agents Chemother. 2001 November; 45(11): 3001–3008.

doi: 10.1128/AAC.45.11.3001-3008.2001.

PMCID: PMC90774

Copyright © 2001, American Society for Microbiology


Účinky Azithromycinu a Rifampinu na infekci Chlamydia trachomatis, studie In Vitro

Ute Dreses-Werringloer, Ingrid Padubrin, Henning Zeidler, and Lars Köhler*


Department of Internal Medicine, Division of Rheumatology, Medical School Hannover, Hannover, Germany


*Corresponding author. Mailing address: Department of Rheumatology, Medical School Hannover, Carl-Neuberg-Strasse 1, 30625 Hannover, Germany. Phone: 49/511-5322319. Fax: 49/511-5325841. E-mail: Koehler.Lars@mh-hannover.de.


Současná adresa: Department of Immunology and Microbiology, Wayne State University, School of Medicine, Detroit, MI 48201.

Zasláno 18. dubna, 2001; Opravy vyžádány 21. června, 2001; přijato 9. srpna, 2001.

Tento článek byl citován dalšími články v PMC.


Poznámka překladatele do češtiny: překladatel je zběžný v angličtině a v překladu z angličtiny do češtiny, nikoli však v odborné terminologii, proto se v české verzi mohou objevit formulace, které úplně neodpovídají medicinské a biologické terminologii v českém jazyce. Věřím, že v převážné většině případů to nebude na újmu srozumitelnosti. Několik ryze odstavců v kapitole Metody výzkumu nebylo z těchto důvodů přeloženo. Zásadní sdělení článku je však patrné v kapitolách Výsledky a Diskuse.



Abstract

Abstrakt

An in vitro cell culture model was used to investigate the long-term effects of azithromycin, rifampin, and the combination of azithromycin and rifampin on Chlamydia trachomatis infection. Although standard in vitro susceptibility testing indicated efficient inhibition by azithromycin, prolonged treatment did not reveal a clear elimination of chlamydia from host cells. Chlamydia were temporarily arrested in a persistent state, characterized by culture-negative, but viable, metabolically active chlamydia, as demonstrated by the presence of short-lived rRNA transcripts. Additionally, azithromycin induced generation of aberrant inclusions and an altered steady-state level of chlamydial antigens, with the predominance of Hsp60 protein compared to the level of the major outer membrane protein. Treatment with azithromycin finally resulted in suppression of rRNA synthesis. Chlamydial lipopolysaccharide and processed, functional rRNA were detectable throughout the entire incubation period. These in vitro data show a good correlation to those from some recent clinical investigations that have reported on the persistence of chlamydia, despite appropriate antibiotic treatment with azithromycin. Rifampin was highly active by in vitro susceptibility testing, but prolonged exposure to rifampin alone for up to 20 days resulted in the emergence of resistance. No development of resistance to rifampin was observed when chlamydia-infected cells were incubated with a combination of azithromycin and rifampin. This combination was shown to be more efficient than azithromycin alone, in that suppression of rRNA synthesis occurred earlier. Thus, such a combination may prove more useful than azithromycin alone.

Model buněčné kultury in vitro byl použit pro zkoumání dlouhodobého efektu azithromycinu, rifampinu a jejich kombinace na infekci Chlamydiemi trachomatis. Třebaže standardní testy na citlivost in vitro naznačují dostatečnou inhibici pomocí azithromycinu, úplná eliminace chlamydií z buněk hostitele se ani po dlouhodobé terapii neprokázala. Chlamydie byly dočasně uvězněny v persistentním stavu, v němž byla kultivace na patogeny negativní, avšak zůstaly životaschopné a metabolicky aktivní, což bylo prokázáno přítomností zápisu rRNA. Použití azithromycinu kromě toho vyvolalo tvorbu abnormálních inkluzí a změněnou úroveň protilátek na chlamydie, v nichž převládal protein Hsp60 v porovnání s množstvím hlavního proteinu vnější membrány. Použití azithromycinu také způsobilo potlačení rRNA syntézy. Chlamydiové lipopolysachardy a zpracovaná funkční rRNA byly detekovány během celé inkubační doby. Tyto in vitro údaje svědčí o dobré korelaci s výsledky některých klinických výzkumů z poslední doby, které prokázaly persistenci chlamydií při použití tradiční léčby azithromycinem. Při testech citlivosti in vitro byl rifampin vysoce aktivní, ale jeho dlouhodobé použití po dobu dvaceti dnů vedlo ke vzniku resistence. Avšak když byly buňky nakažené Chlamydiemi léčeny kombinací azithromycinu a rifampinu, vznik rezistence pozorován nebyl. Tato kombinace se ukázala být účinnější než samostatně použitý azithromycin a to v tom, že k potlačení syntézy rRNA došlo rychleji. Tato kombinace antibiotik tedy může být vhodnější než azithromycin samotný.

 

 

Infections caused by the obligate intracellular bacterium Chlamydia trachomatis are among the most prevalent causes of ocular and urogenital diseases worldwide. Clinical manifestations of acute infections related to C. trachomatis serovars A to C or serovars D to K are trachoma or cervicitis and urethritis, respectively. These infections can progress to persistent infections, which may initiate a pathogenic process that leads to chronic diseases including blindness or pelvic inflammatory disease, ectopic pregnancy, tubal factor infertility, and chlamydia-induced arthritis, including Reiter's syndrome.

Infekce způsobené nitrobuněčnou bakterií Chlamydia trachomatis jsou nejčastější příčinou očních a urogenitálních nemocí na celém světě. Klinická manifestace akutní infekce způsobené serovary A až C je trachom nebo cervitida a serovary D až K způsobují utetritidu. Tyto infekce se mohou vyvinout do persistentního stavu, který způsobí patogenní projevy vedoucí k chronickým chorobám, včetně slepoty nebo PID, mimoděložního těhotenství, neplodnosti, reaktivní artritidy a Reiterova syndromu.

Standard therapy for acute urogenital tract infections is a 7-day course of doxycycline or a single dose of azithomycin. Both regimens have been shown to result in satisfactory cure rates in clinical trials (20, 21, 32, 34, 40, 43, 49).

Konvenční terapie akutní infekce urogenitálního traktu je doxycycline po dobu 7 dní nebo jediná dávka azithromycinu. Oba přístupy prokázaly uspokojivé léčebné výsledky při klinických testech (20, 21, 32, 34, 40, 43, 49).

Relapsing chlamydial infections are, however, a common problem, even though patients are often treated appropriately (6, 24, 56). Usually, recurrent infections are supposed to be a consequence of reinfection. Most of the clinical trials that have addressed relapsing chlamydial infections did not distinguish between reinfection and relapse and thus did not define the role of persistence. There are, however, recent reports of recurrent infections after appropriate antibiotic treatment which appeared to be a result of the persistence of chlamydia (15, 25, 38).

Avšak opakující se chlamydiové infekce jsou častým problémem i přesto, že pacienti jsou konvenčně léčeni správně (6, 24, 56). Obvykle se má za to, že opakující se infekce je následkem re-infekce. Většina klinických studií, které se zabývaly opakující se infekcí nedělaly rozdíl mezi reinfekcí a recidivou, takže roli persistence nedefinovaly. V poslední době se však ukazuje stále více zpráv o recidivách po aplikaci standardní terapie a zdá se, že tyto recidivy jsou důsledkem persistence chlamydií (15, 25, 38).

This observation presents an apparent contradiction to results of determination of the MIC and the minimum bactericidal concentration (MBC), which clearly indicated successful suppression of chlamydial growth by clinically used antibiotics. The experimental setting involved with this kind of in vitro testing is, however, not truly reflective of the situation in vivo for chlamydial infection. In natural infections, chlamydia are usually exposed to antimicrobials long after an infection has been well established. In contrast, the conventional in vitro systems used for susceptibility testing represent a quite different condition, in that antibiotics are added usually 48 h after the infectious agent is added or are sometimes added simultaneously with the infectious agent. Recently, we could demonstrate that ciprofloxacin and ofloxacin not only failed to eradicate chlamydia from host cells but induced a persistent infection, although both antibiotics are efficient in susceptibility testing (16). Using this in vitro model, we investigated the efficacies of azithromycin, rifampin, and the combination of azithromycin and rifampin for the elimination of chlamydia from epithelial cells.

Toto pozorování představuje zřejmý rozpor s výsledky, které určují MIC a minimální bakteriální koncentraci (MBC), a které jednoznačně stanovily potlačení růstu chlamydií klinicky užívanými antibiotiky. Podmínky, jaké panují při těchto testech in vitro, však ve skutečnosti neodpovídají situaci při nákaze chlamydiemi in vivo. Při přirozené infekci jsou chlamydie vystaveny působení antibiotiky až dlouho po tom, co se nákaza plně prosadí. Naproti tomu konvenční systémy in vitro užívané k testům citlivosti představují zcela odlišné podmínky, zejména v tom, že antibiotika jsou podány obvykle 48 hodin po vložení infekční bakterie a nebo jsou dokonce někdy aplikovány společně s bakterií. Nedávno jsme byli schopni demonstrovat, že ciprofloxacin a ofloxacin nejenže nedokázaly chlamydie vyhubit z hostitelských buněk, ale navíc vyvolaly persistentní infekci, třebaže jsou obě antibiotika účinná při testech citlivosti (16). Metodou in vitro jsme zkoumali účinnost azithromycinu, rifampinu a kombinace obou při eliminaci chlamydií z epitelových buněk.

MATERIALS AND METHODS

Materiál a metody

Cells. Cells of the HEp-2 cells line, a human laryngeal epidermoid cell line, were maintained at 37°C with 5% CO2 in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum (Seromed, Berlin, Germany), 1% l-glutamine, and 100 μg of gentamicin (Seromed) per ml.

 

Growth, purification, and titration of chlamydia. C. trachomatis serovar K/UW-31/Cx (obtained from the Washington Research Foundation, Seattle) was cultured in HEp-2 cells, as described recently (28). Briefly, at 48 h postinfection the chlamydia were harvested, purified on a discontinuous Renografin gradient (Schering, Berlin, Germany) (10), resuspended in SPG buffer (0.01 M sodium phosphate [pH 7.2], 0.25 M sucrose, 5 mM l-glutamic acid), and stored at −80°C. The infectivity of the chlamydia was expressed as the number of inclusion-forming units (IFU) per milliliter.

 

Determination of MICs and MBCs. Determination of the MICs and the MBCs was performed as described recently (16). The MIC was defined as the lowest drug concentration required to inhibit development of chlamydial inclusions after 48 h of incubation. The MBC was defined as the lowest concentration of antibiotic required to suppress generation of infectious chlamydia, as measured by the development of inclusions after passage to fresh HEp-2 cell monolayers. Inclusions were visualized by staining with fluorescein isothiocyanate-conjugated antibody directed against major outer membrane proteins (MOMPs Behring, Schwalbach, Germany).

 

Infection and treatment with antibiotics. Azithromycin (Pfizer, Karlsruhe, Germany) and rifampin (Sigma, Deisenhofen, Germany) were supplied as powders and were solubilized according to the manufacturers' instructions. Infection and antibiotic treatment were performed as described previously (16). Briefly, antibiotic-free cultured HEp-2 cells were inoculated with C. trachomatis elementary bodies EBs; multiplicity of infection [MOI], 0.05). Incubation with 0.5 or 1.0 μg of azithromycin per ml, 0.015 μg of rifampin per ml, or the combination of 0.5 μg of azithromycin per ml and 0.015 μg of rifampin per ml was started 2 days after infection.

Nákaza a medikamenty.
Azithromycin (Pfizer, Karlsruhe, Germany) a rifampin (Sigma, Deisenhofen, Germany) byly dodány ve formě prášku a byly rozpuštěny podle instrukcí výrobce. Infekce a podání medikamentů byly provedeny jak bylo uvedeno výše (16). Kultura bez antibiotik byla infikována elementárními tělísky (EB) Chlamydie trachomatis, multiplicita infekce [MOI] 0.05). Dva dny po infekci byla provedena inkubace azithromycinem 0.5 nebo 1.0 μg na ml, rifampinem 0.015 μg na ml, nebo kombinací 0.5 μg azithromycinu na ml a 0.015 μg rifampinu na ml.

Immunofluorescence assays. Visualization of inclusions was done by staining with Hsp60-specific antibody GP 57-19 (kindly provided by R. P. Morrison, Hamilton, Mont.) (16). Fluorescence microscopy was performed with an epifluorescence microscope (Leitz, Wetzlar; Germany). The number of inclusions was counted and was expressed as the number of inclusion bodies per 105 cells.

Rozbor pomocí imunofluorescenční metody. Vizualizace inkluzí byla provedena pomocí barvení protilátek GP 57 specifických na Hsp60 (laskavě poskytnutých panem R. P. Morrisonem, Hamilton, Montana) (16). Fluorescenční mikroskopie byla provedena pomocí epifluorescenčního mikroskopu (Leitz, Wetzlar; Germany). Byl stanoven počet inkluzí a vyjádřen počtem inkluzí na 105 buněk.


Detection of infectious chlamydia. Chlamydial infectivity was determined by titration of cell lysates on confluent HEp-2 cell monolayers (47). After 48 h of incubation, inclusions were visualized by an immunoperoxidase assay (39). The number of inclusions was expressed as the number of IFU/105 cells.

Zjištění chlamydiové infekce.

SDS-PAGE and immunoblotting. The protein contents of the harvested cells were determined by a micro-Bradford protein assay (Bio-Rad, Munich, Germany) with bovine serum albumin as the standard. Samples of 50 μg of total protein were solubilized by boiling in Laemmli sample buffer and were separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) (12 or 15% acrylamide) (31). The separated proteins were transferred electrophoretically to a polyvinylidene difluoride membrane (Millipore, Bedford, Mass.). After blocking of the blots in nonfat dried milk powder in phosphate-buffered saline or Roti-Block (Roth, Karlsruhe, Germany), the blots were probed with either anti-Hsp60 (GP 57-5), anti-MOMP (LV-21), or anti-lipopolysaccharide (anti-LPS; S 25-23; kindly provided by H. Brade, Borstel, Germany) antibodies. Antibody bound to chlamydial antigens was detected with alkaline phosphatase-conjugated rabbit or goat anti-mouse immunoglobulin G (Dianova, Hamburg, Germany) and subsequent staining with 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate–nitroblue tetrazolium (Sigma).

 

RT-PCR analysis. Infected or uninfected cells were harvested by centrifugation, washed twice with Hanks balanced salt solution, snap-frozen in liquid N2, and stored at −80°C until use. Total RNA was extracted with an RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer's instructions. Prior to reverse transcription (RT) reactions, RNA was treated with RNase-free DNase I (Life Technologies, Gibco-BRL, Karlsruhe, Germany) or RQ1 DNase (Promega, Mannheim, Germany). For RT, 1 μg of RNA was incubated with 200 U of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase or Superscript II RNase H (Life Technologies, Gibco-BRL) and 100 pmol of primer DS by using the buffers and conditions specified by the manufacturer.

 

Amplification of unprocessed 16S rRNA transcripts was performed as described recently (17). Demonstration of functional rRNA was done by RT-PCR with downstream primer DS and upstream primer US2b (5′-TTCAGATTGAACGCTGGCGGCGTGGATG-3′), whose sequence is specific for the coding region of the rRNA operon. PCR was carried out in a total volume of 100 μl with 0.3 μM primers and buffers, as described above (17). The reaction mixtures were subjected to an initial denaturation step at 95°C for 5 min and 35 cycles of amplification, performed in a Perkin-Elmer 9600 thermocycler as follows: 1 min of denaturation at 95°C, 1 min of annealing at 60°C, and 1 min of primer extension at 72°C with a final extension at 72°C for 10 min. The PCR products were visualized by electrophoresis on agarose gel stained with ethidium bromide.

 

RESULTS

Výsledky

Determination of MICs and MBCs. The MICs, which were the lowest concentrations required to inhibit development of chlamydial inclusions, were 0.25 μg/ml for azithromycin and 0.0075 μg/ml for rifampin. The MBCs, which were defined as the lowest concentrations required to prevent formation of chlamydial inclusions after passage, were 0.5 μg/ml for azithromycin and 0.01 μg/ml for rifampin.

Určení MIC a MBC. MIC, čili nejnižší koncentrace potřebná k potlačení růstu chlamydiových inkluzí, byla u azithromycinu 0.25 μg/ml a u rifampinu 0.0075 μg/ml. MBC, definované jako nejnižší koncentrace potřebná k zamezení formování chlamydiových inkluzí po podání, bylo 0.5 μg/ml u azithromycinu a 0.01 μg/ml u rifampinu.

Effect of azithromycin on growth of C. trachomatis. Treatment was started after chlamydial infection had been established, i.e., 2 days after inoculation. The influences of two different concentrations of azithromycin, 0.5 and 1.0 μg/ml, on chlamydial growth were assessed by determination of the numbers of infectious chlamydia and the presence of inclusions. Table 1 shows the effect of the drug on the yield of infectious chlamydia. Both concentrations had equivalent activities in inhibiting productive growth. A significant decrease in infectivity was observed after addition of the drug, resulting in a loss of infectivity after 8 and 6 days with treatment with 0.5 and 1.0 μg of azithromycin per ml, respectively. Although infectious chlamydia could not be recovered on days 8 and 10 after treatment with the two concentrations, respectively, chlamydial inclusions were present for significantly longer periods. At 2 days after infection, inclusions had developed in about 0.8% of host cells, and the numbers of inclusions continuously decreased by treatment with azithromycin (Fig. 1). Typical inclusions could be found only until day 8. Quantification of inclusions was, however, difficult during the later period of culture due to the presence of small atypical inclusions. Single smaller inclusions were detectable for 14 days.

Účinky azithromycinu na růst C. trachomatis. Podání antibiotik začalo až po tom, co se nákaza plně prosadila, tedy dva dny po infekci. Zjišťován byl vliv dvou různých koncentrací azithromycinu a to 0.5 a 1.0 μg/ml a to určením počtu infekčních chlamydií a přítomností inkluzí. Tabulka 1 ukazuje účinky antibiotika na úrodu nakažlivých chlamydií. Obě koncentrace vykázaly shodnou účinnost na inhibici růstu. Po podání antibiotika bylo pozorováno významné snížení infekce a ta byla plně zastavena po 8 dnech při 0.5 a po 6 dnech při 1.0 μg azithromycinu na ml. Přestože nebylo možné infekční chlamydie obnovit po 8 a 10 dnech za daných koncentrací, chlamydiové inkluze byly přítomné po významně delší dobu. Dva dny po infekci se vytvořily inkluze u asi 0.8% hostitelských buněk a počet inkluzí při podávání azithromycinu trvale klesal (Fig. 1). Typická inkluze se dala nalézt pouze do osmého dne. V pozdějším období nákazy byla však kvantifikace inkluzí obtížná kvůli přítomnosti malých atypických inkluzí. Jednotlivé menší inkluze bylo možno pozorovat po celou dobu dvou týdnů kdy studie probíhala.

Poznámka překladatele: To, co je v této studii nazýváno malými atypickými inkluzemi, je v práci doktora Strattona z Vanderbildské university (USA) označováno jako kryptická fáze (cryptic phaze). Stratton ve svém mnohaletém výzkumu prokázal, že léčba antibiotiky chlamydie úplně nevyhubí, ale zažene je do kryptické fáze, v níž se sice nerozmnožují, avšak v níž nejsou pro tělo zcela neškodné a navíc se po odstranění antibiotik mohou znovu probudit do metabolizující formy. Výsledky jeho výzkumu dále ukázaly, že tuto kryptickou fázi lze ničit pomocí metronidazolu a že úplné vyhubení chlamydií je pravděpodobné pouze při použití kombinace dvou antibiotik a metronidazolu. Výzkum doktora Strattona je zaměřen převážně na Chlamydii pneumonia, avšak po mém dotazu e-mailem mě Dr. Straton ujistil, že metronidazol je účinný i na kryptickou fázi C. trachomatis.

Chlamydial viability during treatment with azithromycin. Several in vitro studies have demonstrated that an abrogation or deviation from the typical developmental cycle could be induced by gamma interferon (IFN-γ) penicillin, ciprofloxacin, ofloxacin, or depletion of essential amino acids with this deviation resulting in a culture-negative but viable state for the chlamydia (2, 13, 16, 29, 35). Hence, the failure to detect infectious chlamydia does not necessarily exclude the presence of viable bacteria. Therefore, we used an RT-PCR analysis that targets unprocessed 16S rRNA transcripts and that provides a sensitive method for the identification of viable chlamydia. Such transcripts are detectable only in viable, metabolically active organisms and are processed to functional rRNA rapidly (16); thus, their presence indicates the viability of the chlamydia infecting host cells.

 


Životaschopnost chlamydií během podávání azithromycinu. Několik studií in vitro prokázalo, že zastavení nebo změnu typického životního cyklu lze navodit pomocí gamma interferonu (IFN-γ) penicillinu, ciprofloxacinu, ofloxacinu, nebo vyčerpáním základních aminokyselin, což vede ke stavu, v němž jsou chlamydie při kultivaci negativní, avšak životaschopné (2, 13, 16, 29, 35). To znamená, že kultivační negativita nemusí vždy znamenat, že v těle nejsou životaschopné bakterie. Z tohoto důvodu jsme použili analýzu RT-PCR, která je zaměřená na nezpracované zápisy 16S rRNA a která má vysokou citlivost pro určení přítomnosti životaschopné chlamydie. Takové zápisy lze určit pouze v životaschopném, metabolicky aktivním organismu a lze je rychle zpracovat na funkční rRNA (16); Jejich přítomnost tedy ukazuje na přežívání chlamydií v nakažených buňkách hostitele.

RT-PCR assay demonstrated unprocessed transcripts in cells treated with 0.5 μg of azithromycin per ml for 16 days (Fig. 2A). Incubation with the higher concentration of 1.0 μg/ml resulted in a slightly better inhibition since unprocessed rRNA was present only for 12 days (data not shown).

Test RT-PCR prokázal nezpracované zápisy v buňkách léčených 0.5 μg/ml azithromycinu po dobu 16 dnů (obrázek. 2A). Použití vyšší koncentrace 1.0 μg/ml vedlo k o něco lepší inhibici, neboť nezpracované rRNA byly přítomny pouze 12 dní (data neuvedena).

RT-PCR analysis with upstream primer US2b, whose sequence is specific for the coding region of the rRNA operon, offers a method for the detection of unprocessed and functional, processed 16S rRNA. Samples which were shown to be negative for unprocessed 16S rRNA transcripts were analyzed to detect processed, functional rRNA. Although de novo synthesis of rRNA was inhibited during the later stage of incubation with antibiotic, functional rRNA was detectable throughout the entire period (Fig. 2B). The same result was obtained with the higher drug concentration of 1.0 μg/ml (data not shown).

 

Analýza RT-PCR pomocí vzestupného primeru US2b, jehož sekvence je specifická pro kódovací oblast rRNA operonu, nabízí metodu pro detekci nezpracovaných a funkčních, zpracovaných 16S rRNA. Vzorky, které se ukázaly jako negativní při nezpracovaných zápisech 16S rRNA byly analyzovány pro zjištění zpracovaných funkčních rRNA. Ačkoli syntéza rRNA de novo byla inhibována během pozdní fáze nasazení antibiotik, funkční rRNA byla zjistitelná po celou dobu (Fig. 2B). Při vyšší koncentraci (1.0 μg/ml) byl výsledek stejný (data neuvedena).

Analysis of chlamydial antigens during treatment with azithromycin. Antigen analyses were done to investigate the effect of azithromycin on key chlamydial antigens. The antigens assessed were MOMP, Hsp60, and LPS. Hsp60 and LPS have been implicated in the elicitation of strong immunopathogenic reactions (22, 36, 37). MOMP, a major structural constituent of the chlamydial outer envelope, is thought to play a role in protective immunity (9, 14, 50, 58). In vitro persistent infection induced by IFN-γ, iron depletion, or ciprofloxacin is characterized by an obvious imbalance of chlamydial antigens, with near normal levels of Hsp60 and significantly down-regulated levels of MOMP (2, 16, 44). According to the ability of azithromycin to inhibit bacterial protein synthesis, synthesis of MOMP and Hsp60 was suppressed within the culture period. Development of atypical inclusions upon azithromycin treatment was associated to some extent with decreasing levels of both chlamydial antigens. No MOMP could be demonstrated in HEp-2 cells by immunoblotting for 8 days after infection, whereas Hsp60 was detectable in HEp-2 cells for up to 14 days after infection (Fig. 3). Chlamydial LPS was present throughout the entire incubation period, although the amount was decreased (Fig. 3C).

Analýza chlamydiových antigenů během působení azithromycinu. Kvůli zjištění účinků azithromycinu na klíčové chlamydiální antigeny byla provedena analýza antigenů. Hodnocené antigeny byly MOMP, Hsp60, a LPS. Jak již bylo zjištěno, antigeny Hsp60 a LPS mají na svědomí silné imunopatologické reakce (22, 36, 37). Má se za to, žeantigen MOMP, který je významnou strukturální složkou vnějšího obalu chlamydií, hraje roli při obranné imunitě (9, 14, 50, 58). Persistentní nákaza in vitro vlivem IFN-γ, úbytkem želena nebo ciprofloxacinem je charakteristická výraznou nerovnováhou chlamydiových antigenů, přičemž Hsp60 je na téměř normální úrovni zatímco MOMP je významně potlačen (2, 16, 44). Vzhledem k tomu, že azithromycin je schopen potlačit syntézu bílkovin bakterií, byla během jeho použití potlačena syntéza MOMP a Hsp60. Rozvoj atypických inkluzí při podávání azithromycinu byl do jisté míry způsoben snížením počtu obou chlamydiových antigenů. Osm dní po infekci nebylo pomocí immunoblottingu možno zjistit žádné MOMP látky v buňkách HEp-2, zatímco Hsp60 byly zjistitelné i 14 dní po infekci (obrázek 3). Chlamydiové LPS byly přítomny po celou dobu testu, ačkoli jejich množství se snížilo (obrázek 3C).

Treatment with a higher concentration of azithromycin (1.0 μg/ml) resulted in slightly more efficient suppression, as shown by the lack of detection of both Hsp60 and MOMP 2 days earlier than the time of a lack of protein detection observed for the lower concentration of 0.5 μg/ml (data not shown).

 


Nasazení vyšší koncentrace azithromycinu vedla k o něco lepšímu potlačení, jak ukázala nepřítomnost Hsp60 a MOMP 2 o dva dny dříve než při nižší koncentraci 0.5 μg/ml (data neuvedena).

Effects of rifampin and the combination of rifampin and azithromycin on chlamydial infection. Since rifampin has been shown to be very active against C. trachomatis in a number of in vitro cell culture studies (4, 5, 8, 11, 12, 23, 45, 57), we decided to test rifampin alone and the combination of rifampin and azithromycin to gain a better inhibition in our cell culture model. Infection of treated cells was monitored by detection of infectious chlamydia, inclusions, and unprocessed 16S rRNA transcripts at days 4, 8, 14, and 20 after infection. Table 2 shows the effects of the antimicrobial drugs on infectious progeny. All three regimens suppressed productive growth. Few infectious bacteria were detectable at day 8 when cells had been treated with azithromycin or rifampin alone. With the combination of both antibiotics, no infectious chlamydia were detected 8 days after infection.

Účinek rifampinu a konbinace rifampinu a azithromycinu na chlamydiovou nákazu. Jelikož velký počet studií prokázal, že rifampin je velmi aktivní na C. trachomatis (4, 5, 8, 11, 12, 23, 45, 57), rozhodli jsme se ověřit, zda rifampin samotný nebo v kombinaci s azithromycinem má lepší inhibici v našem modelu nákazy. Infekce léčených buněk byla monitorována detekcí infekčních chlamydií, inkluzí a nezpracovaných zápisů 15s rRNA a to 4, 8, 14 a 20 dní po nákaze. Tabulka 2 ukazuje účinky antimikrobiálních látek na infekci. Všechny tři léčebné plány potlačily produktivní růst. Při použití samotného azithromycinu nebo rifampinu bylo po osmi dnech možno zjistit jen malé množství infekčních bakterií.

Antibiotic treatment of infected cells had to be done substantially longer to eliminate chlamydial inclusions from host cells. The number of inclusions was significantly reduced at day 4 for about 74 to 85% of the cells (Fig. 4). At day 8 only single inclusions that were significantly smaller than typical ones found in untreated cells were present. Host cells were found to be free of typical inclusions at 14 days postinfection for all three treatment regimens. As already shown for azithromycin, generation of atypical small inclusions during treatment occurred, and this was observed at days 4, 8, and 14.

 

Pro eliminaci chlamydiových inkluzí z buněk hostitele muselo být působení antibiotik na nakažené buňky významně delší. Po čtyřech dnech byl počet inkluzí výrazně snížen u 74 až 85% buněk (obr. 4). Po osmi dnech byly přítomny pouze jednotlivé inkluze a ty byly znatelně menší než typické inkluze v neléčených buňkách. Buňky hostitele byly zbaveny typických inkluzí po 14 dnech po infekci a to při všech třech léčebných plánech. Jak bylo zmíněno výše u azithromycinu, během působení antibiotik došlo k tvorbě atypických malých inkluzí a toto bylo pozorováno 4, 8 a 14 dní po infekci.

Azithromycin, rifampin, and the combination of both drugs were all sufficient to suppress de novo synthesis of rRNA (Fig. 5A). Unprocessed transcripts are detectable in cells treated with azithromycin alone on days 4, 8, and 14. Rifampin and the combination of azithromycin and rifampin were shown to be more effective, as demonstrated by the presence of primary rRNA only on days 4 and 8. Nevertheless, use of primer US2b, whose sequence is specific for the coding region of the 16S rRNA gene, in another assay demonstrated functional rRNA throughout the entire period of incubation with azithromycin, rifampin, or azithromycin plus rifampin (Fig. 5B).

 

Jak Azithromycin, tak rifampin a jejich kombinace byly účinné pro potlačení syntézy rRNA de novo (obr. 5A). Nezpracované zápisy jsou zjistitelné v buňkách léčených azithromycinem po 4, 8 a 14 dnech. Rifampin a kombinace obou látek se ukázaly jako účinnější, což bylo prokázáno přítomností primární rRNA už po 4 a 8 dnech. Avšak použití US2B primeru, jehož sekvence je specifická pro kódovací oblast genu 16S rRNA prokázalo funkční rRNA po celou dobu působení azithromycinu, rifampinu i jejich kombinace (obr. 5B).

Development of rifampin-resistant chlamydia. Although incubation with rifampin alone was generally active in the inhibition of chlamydial growth and suppression of rRNA synthesis, in some cases recurrent infection with the appearance of typical inclusions and the recovery of infectious chlamydia occurred.

 

Vznik resistence chlamydií na rifampin.
Ačkoli použití samotného rifampinu bylo obecně účinné na potlačení růstu chlamydií a potlačení syntézy rRNA, v některých případech se vyskytla recidiva infekce, při níž se projevil výskyt typických inkluzí a obnova infekčních chlamydií.

To verify the development of resistant strains, the MICs of rifampin for these chlamydial isolates were determined. The original chlamydia were tested in parallel as control organisms with known susceptibility to rifampin. The results of in vitro susceptibility testing are summarized in Table 3. The data clearly show the emergence of resistance for all isolates tested, with MICs ranging from 4 to 256 μg/ml, whereas the MIC for the original stock of chlamydia was 0.0075 μg/ml. This phenomenon was observed in two independent experiments after incubation with rifampin alone for at least 12 days in 3 of 50 wells (6%) and 2 of 18 wells (11%), respectively. Simultaneous incubation of chlamydia-infected cells with azithromycin and rifampin prevented the emergence of resistance to rifampin.

Pro ověření rezistentních řetězců byl určen MIC rifampinu na tyto chlamydiové izoláty. Současně byla testována původní chlamydie, citlivá na rifampin. Výsledky citlivosti in vitro jsou shrnuty v tabulce 3. Údaje jasně ukazují na vývoj resistence u všech testovaných jednotek a to při MIC v rozsahu od 4 do 256 μg/ml, zatímco MIC pro původní chlamydii byl 0.0075 μg/ml. Tento fenomén byl pozorován během dvou nezávislých experimentů po nasazení samotného rifampinu po dobu alespoň 12 dní ve třech z padesáti sond (6%) a ve dvou z 18 sond (11%). Simultánní nasazení azithromycinu a rifampinu na nakažené buňky zabránilo vzniku rezistence na rifampin.

 

 

DISCUSSION

Diskuse

Although regimens for the treatment of acute chlamydial urogenital infections are well established, there are recent reports of the persistence of chlamydia, despite appropriate antibiotic treatment with doxycycline or azithromycin (15, 25). These observations are in contrast to those from conventional in vitro susceptibility testing, which clearly indicated good activity. An experimental setting of this kind, however, is not truly reflective of the situation in vivo for chlamydial infection, since determination of the MIC is done by addition of the antibiotics soon after infection of the cell culture or sometimes simultaneously with infection of the cell culture. Some studies have shown an increase in the MIC when the antibiotic is added up to 24 h after inoculation (41, 42). The main disadvantage of these models is the short incubation period of at most 72 h, which is not sufficient to investigate whether the drugs are capable to eradicate chlamydia from the host cells. Therefore, we established a cell culture system by consideration of this point, in that we used a longer incubation period of 20 days (16). Using this model, we could demonstrate that in vitro treatment with ciprofloxacin and ofloxacin induced a state of chlamydial persistence, although determination of the MIC and the MBC clearly indicated successful suppression of chlamydial growth.

Třebaže léčebné plány pro akutní chlamydiové urogenitální infekce jsou dobře zavedeny, v poslední době se objevuje stále více zpráv o persistenci chlamydií i po nasazení standardní léčby doxycyclinem nebo azithromycinem (15, 25). Tato zjištění jsou v rozporu s konvenčními testy na citlivost in vitro, při nichž byla účinnost prokázána. Pro chlamydiové infekce však experimentální prostředí in vitro plně neodpovídá situaci in vivo, protože zjištění MIC se provádí po přidání antibiotik brzy po infekci buněčné kultury nebo dokonce současně s infekcí. Některé studie ukázaly navýšení MIC, když jsou antibiotika podána 24 hodin po nákaze (41, 42). Hlavní nevýhodou těchto modelů zkoumání je krátká inkubační doba, nanejvýše 72 hodin, což je nedostatečné, má-li být zjištěno, zda jsou antibiotika schopna vyhladit chlamydii z hostitelských buněk. Proto jsme stanovili metodu, při níž jsme použili delší inkubační dobu dvaceti dní. Užitím tohoto modelu jsme byli schopni prokázat, že nasazení ciprofloxacinu a ofloxacinu in vitro vyvolalo stav persistence chlamydie, a to i přesto, že určení MIC a MBC zcela jednoznačně prokazovala úspěšné zastavení růstu chlamydií.

In the present study we could show by conventional susceptibility testing that azithromycin has good activity, as demonstrated by an MIC of 0.25 μg/ml and an MBC of 0.5 μg/ml. These results are within the ranges reported by others (1, 7, 33, 46, 48, 52, 53, 54). Extended treatment of an established chlamydial infection with azithromycin did not reveal a clear elimination of the chlamydia. The course of infection in HEp-2 cells treated with azithromycin was characterized by three distinct stages. Infectious chlamydia and typical inclusions were found during the first stage. Further incubation with azithromycin, however, suppressed generation of infectious bacteria, resulting in a culture-negative state after 8 or 10 days. Synthesis of rRNA could be detected for substantially longer times than infectious organisms could. That means that chlamydia are temporarily arrested in a nonproductive, but viable state. Inclusion morphology was affected by azithromycin, as shown by the development of aberrant, small inclusions whose numbers decreased during further treatment. Additionally, an imbalance between chlamydial Hsp60 and MOMP, with a predominance of Hsp60, was noted during this stage of culture. It appeared that azithromycin treatment resulted in a temporary persistence, which shows some striking similarities to in vitro models, as persistence was induced by exposure to IFN-γ, ciprofloxacin, or ofloxacin or depletion of essential nutrients (2, 13, 16). Chlamydia that had restricted growth but that were also viable longer than infectious organisms were also detected. An altered antigen profile was additionally shown for cells whose growth was arrested by exposure to IFN-γ, ciprofloxacin, and ofloxacin.

V naší studii jsme byli schopni prokázat, že při konvenčních testech citlivosti má azithromycin dobrou aktivitu, jak bylo ukázáno na MIC 0.25 μg/ml a MBC of 0.5 μg/ml. Tyto výsledky jsou v souladu se zjištěním jiných výzkumu (1, 7, 33, 46, 48, 52, 53, 54). Prodloužení doby nasazení azithromycinu neprokázalo eliminaci chlamydií.Vývoj infekce v buňkách HEp-2 léčených azithromycinem byl charakterizován třemi rozdílnými fázemi. V první fázi byly přítomny nakažlivé chlamydie a typické inkluze. Avšak další nasazení azithromycinu potlačilo vývoj infekčních bakterií a po 8 a 10 dnech vedlo k vývoji stavu, v němž jsou kultivačně negativní. Syntéza rRNA byla zjistitelná po významně delší dobu než infekční organismy. To znamená, že chlamydie byly dočasně uvězněny v nemetabolizujícím, avšak životaschopném stavu. Také morfologie inkluzí byla azithromycinem ovlivněna, jak prokázal výskyt atypických malých inkluzí, jejichž výskyt se během další léčby snižoval. Kromě toho byla během této fáze pozorována nerovnováha mezi chlamydiovými Hsp60 a MOMP, kdy převládaly Hsp60. Zdá se, že podání azithromycinu vedlo k dočasné persistenci, která projevuje některé zarážející podobnosti s modely in vitro, neboť persistence byla navozena expozicí IFN-γ, ciprofloxacinem, ofloxacinem nebo vyčerpáním nepostradatelných živin (2, 13, 16).

Finally, exposure of infected cells to azithromycin was successful in suppressing de novo synthesis of rRNA and the simultaneous disappearance of Hsp60. Chlamydial components such as processed rRNA and LPS, however, persisted in host cells throughout the culture period, even after rRNA synthesis was inhibited.

Aplikace azithromycinu na infikované buňky byla úspěšná v potlačení syntézy rRNA de novo za současného zmizení Hsp60. Avšak chlamydiové komponenty, jako zpracované rRNA a LPS, zůstaly v hostitelských buňkách po celou dobu, dokonce i po zamezení syntézy rRNA.

There may be two explanations for these in vitro results. First, suppression of rRNA synthesis corresponds to a bactericidal effect of azithromycin. The chlamydial components that are present would represent remnants of degraded organisms. These macromolecules may, however, have consequences for the sequelae of chlamydial infections. Some cell wall constituents of bacteria such as LPS are known to hinder the accessibility of cell wall-degrading enzymes (19). It has been reported that C. trachomatis envelopes persist in human polymorphonuclear leukocytes (59). Another in vitro study done by Wyrick and coworkers (55) showed, that following azithromycin exposure of infected epithelial cells, residual chlamydial envelopes can persist in inclusions for up to 4 weeks, although metabolically active reticulate bodies are effectively destroyed. Although chlamydia may be killed, the presence of chlamydial LPS could provide a source for sustained inflammation. Additionally, Wyrick et al. (55) demonstrated that chemotaxis of polymorphonuclear leukocytes is stimulated by epithelial cells containing residual envelopes (55). The role for chlamydial LPS in elicitation of the proinflammatory response was confirmed by Ingalls et al. (22). Purified LPS was shown to induce tumor necrosis factor alpha production from whole blood ex vivo.

Tyto výsledky in vitro mohou být vysvětleny dvěma způsoby. Předně, potlačení syntézy rRNA souvisí s baktericidním účinkem azithromycinu. Přítomné chlamydiové komponenty by pak představovaly zbytky degradovaných organismů. Tyto makromolekuly však možná způsobují pokračování chlamydiové infekce. Některé prvky buněčné stěny bakterií, jako jsou LPS, jsou známé tím, že brání dostupnosti degradačních enzymů buněčné stěny (19). Výzkum také prokázal, že vnější obal C. trachomatis přetrvává v lidských polymorfonukleárních leukocytech (59). Jiná studie in vitro provedená Wyrickem a spol. (55) ukázala, že po nasazení azithromycinu na nakažené buňky epitelu mohou residuální vnější obaly chlamydií setrvávat v inkluzích po dobu až čtyř týdnů a to i přesto, že metabolicky aktivní retikulární tělíska byla účinně zničena. Přestože chlamydie jsou zabity, přítomnost chlamydiových LPS může být příčinou pokračujícího zánětu. Wyrick a spol. navíc prokázali, že buňky, které obsahují zbytkové vnější obaly, stimulují chemotaxi polymorfonukleárních leukocytů (55). Role chlamydiových LPS při navození zánětlivé reakce byla potvrzena ve studii Ingalls a spol (22). Ukázalo se, že očištěné LPS způsobily vznik alfa faktoru nekrózy tumoru z celé krve ex vivo.

The second explanation for the results of the present study is that suppression of rRNA synthesis does not necessarily mean that chlamydia are killed. We cannot entirely exclude the possibility that intact chlamydia which exhibit some kind of metabolic activity are present. Recently, the failure of azithromycin to suppress the growth of Chlamydia pneumoniae in vitro was reported in two studies (18, 30).

Druhým vysvětlením výsledků naší studie je to, že potlačení rRNA syntézy nemusí znamenat zabití chlamydií. Nemůžeme s jistotou vyloučit možnost, že i nadále jsou přítomny nepoškozené chlamydie, které vykazují nějaký druh metabolické aktivity. Dvě nedávné studie ukázaly neschopnost azithromycinu potlačit růst Chlamydie pneumoniae in vitro (18, 30).

Previous clinical trials revealed high cure rates after treatment of acute, urogenital chlamydial infections with azithromycin (20, 21, 32, 34, 40, 41, 49). Surprisingly, the in vitro inhibitory effect of azithromycin developed relatively slowly compared to the time to the development of the inhibitory effect in the in vivo study, and prolonged incubation was not successful in complete eradication of chlamydial antigens. Thus, in vitro data demonstrate an apparent contrast to clinical observations. A critical point that must be kept in mind for these clinical studies is the relatively short follow-up period of 4 weeks. Kjær et al. (27) screened patients with urogenital C. trachomatis infection for recurrent infections after antibiotic treatment. Although the study did not distinguish between reinfection and relapse after antibiotic treatment, the incidence of recurrent infection was 29% during 24 weeks of follow-up after patients had tested negative for C. trachomatis at some point during the first 4 to 8 weeks after treatment. These data strongly suggest that retesting after more than 4 weeks after treatment, substantially longer than was usually done in the studies mentioned above, revealed good clinical results for azithromycin.

Předchozí klinické studie ukázaly vysokou míru vyléčení akutních urogenitálních chlamydiových infekcí azithromycinem (20, 21, 32, 34, 40, 41, 49). Je překvapivé, že inhibiční účinky azithromycinu in vitro se projevily mnohem pomaleji ve srovnání s jejich vývojem ve studiích in vivo, a že prodloužené použití antibiotika nevedlo ke kompletní eradikaci chlamydiových antigenů. Údaje z in vitro studie tedy ukazují na zřejmý kontrast oproti klinickým pozorováním. Musíme tedy vzít v úvahu, že tyto klinické studie měly relativně krátké období přezkoumání a to po čtyřech týdnech. Kjær a spol (27) provedli screening pacientů s urogenitální infekcí C. trachomatis, aby zjistili recidivující infekci po léčbě antibiotiky. Ačkoli tato studie nečinila rozdíl mezi re-infekcí a recidivou, výskyt navracející se infekce byl 29% během 24 týdnů po tom, co měli pacienti negativní test během 4 až 8 týdnů po léčbě. Tyto údaje jsou významným ukazatelem, že opětovné testy provedené mnohem později než po čtyřech týdnech od léčby, prokázaly dobré klinické výsledky aplikace azithromycinu.

Two recent studies have demonstrated an important role for the persistence of chlamydia, despite appropriate antibiotic therapy with azithromycin or doxycycline. Katz et al. (25) presented the results of an epidemiologic study in which they evaluated factors affecting chlamydial persistence or recurrence after treatment with a single dose of azithromycin. They reported a 10% rate of “recurrence” of chlamydial infection 1 month after treatment for male and female adolescents reporting no sexual activity during this period. At 3 months, the recurrence rate was 13%. All patients in this group were found to be culture negative at 1 month. Similar recurrence rates were found for adolescents who used condoms during both time periods. A more detailed study in terms of persistent chlamydial infections was published by Dean et al. (15). They identified 552 women with three or more recurrent cervical infections over a period of >2 years among 11,212 culture-positive women attending a sexually transmitted disease clinic. Of these 552 women, 130 (24%) had recurrences caused by the same serovar. For further genotyping, 45 isolates from seven women with 3 to 10 repeated infections over 2 to 5 years were selected. As determined by omp1 genotyping, four women had identical genotypes at each recurrence and one women was persistently infected with a unique genotype, genotype Ja. Many intervening culture-negative samples were positive when tested by ligase chain reaction. These data strongly suggest that cervical C. trachomatis infections may persist over many years.

Dvě nedávné studie demonstrovaly důležitou roli při persistenci chlamydií po konvenční léčbě antibiotiky s použitím azithromycinu nebo doxycyclinu. Katz a spol (25) představili výsledky epidemiologické studie, v níž vyhodnotili faktory ovlivňující persistenci chlamydie nebo její recidivu po léčbě jediné dávky azithromycinu. Jejich práce ukazuje desetiprocentní (10% ) výskyt "recidivy" infekce v době jednoho měsíce od léčby u dospělých mužů i žen, kteří potvrdili, že neměli během této doby žádné sexuální aktivity. V době po třech měsících byla recidiva 13%. Všichni pacienti v této skupině měli v období jednoho měsíce po léčbě negativní kultivaci. Podobná míra recidivy byla zjištěna u dospívajících, kteří během testovacího období používali kondom. Ještě podrobnější studie ohledně persistence chlamydiové nákazy byla publikována Deanem a spol (15). Mezi 11 212 ženami s pozitivní kultivací na chlamydie identifikovali 552 žen se třemi nebo více recidivujícími cervikálními infekcemi v období méně než dvou let. Z těchto 552 žen jich 130 (24%) mělo recidivu způsobenou stejným serovarem. Za účelem podrobnějšího genotypu bylo vybráno 45 zárodků od sedmi žen, které měly 3 až 10 opakujících se infekcí v době mezi dvěmi až pěti lety. Jak bylo zjištěno genotipizací omp1, čtyři ženy měly tentýž genotyp při každé opakované nákaze a jedna žena byla trvale nakažena unikátním genotype Ja. Mnoho kultivačně negativních vzorků bylo pozitivních při použití testů na ligaseovou řetězovou reakci. Tato data jsou významným ukazatelem, že cervikální infekce C. trachomatis mohou přetrvávat po mnoho let.

The clear difference between former studies reporting high degrees of efficacy in curing chlamydial infections and those published by Katz et al. (25) and Dean et al. (15) is the significantly longer follow-up in the last two studies. Patients were retested over a period of up to 5 years in the study of Dean et al. (15). It is plausible that a follow-up of 4 weeks is too short to detect persistent chlamydia due to the biologic properties, demonstrated in in vitro systems, mentioned above. Thus, the ambiguous inhibitory effects of azithromycin on in vitro chlamydial infections are not necessarily contradictory to the results of clinical trials that have obtained good results with azithromycin. Another important point reported in the study by Dean et al. (15) was a significant association of C class serovars (serovars H, I, Ia, J, and K) with persistent cervical infection, although it is known that the B class serovars (serovars D, E, and F) are the most prevalent serovars in lower genital tract chlamydial infections. We used serovar K, a C class serovar, for our studies, as well as for most in vitro investigations of chlamydial persistence. One may assume that there are particular biologic properties of class C serovars that favor the induction of persistence. Additional in vitro studies are necessary, however, to evaluate a possible correlation between chlamydial serovars and the rate of persistence.

Zásadní rozdíl mezi předchozími studiemi, které prokázaly vysokou účinnost léčby chlamydiových infekcí a těmi publikovanými Katze a spol (25) a Deanem a spol (15) spočívá ve významně delší době následných testů u obou novějších studií. V Deanově studii byli pacienti testování po dobu pěti let. Je pravděpodobné, že provedení následných testů po čtyřech týdnech představuje příliš krátkou dobu na určení persistentních chlamydií vzhledem k jejich biologickým vlastnostem prokázaným in vitro a vysvětleným výše. Dvojznačné inhibiční účinky azithromycinu na chlamydie in vitro nemusejí být v rozporu s výsledky klinických studií, které obhajovaly účinnost tohoto antibiotika. Dalším důležitým faktem ze studie Deana a spol (15) byl významný výskyt persistence cervikální infekce u serovarů třídy C (serovary H, I, Ia, J a K), ačkoli je známo, že serovary třídy B (serovary D, E a F) jsou nejčastějšími serovary chlamydiových infekcí dolního genitálního traktu. My jsme pro naši studii použili serovar K a serovar třídy C. Zdá se, že serovary třídy C mají specifické biologické vlastnosti, které nahrávají vzniku persistence. Další studie in vitro jsou však nezbytné pro vyhodnocení možného vztahu mezi chlamydiovými serovary a mírou persistence.

Rifampin, a potent inhibitor of DNA-dependent RNA polymerase, has been shown to be highly active against C. trachomatis in a number of in vitro studies (3, 8, 11, 12, 23). The rifampin MIC of 0.0075 μg/ml and MBC of 0.01 μg/ml determined in the present study confirmed the high degree of susceptibility of C. trachomatis to rifampin. Long-term treatment of in vitro chlamydial infection, however, resulted in the emergence of resistance. This observation is in agreement with previous data published by Keshishyan et al. (26), Jones et al. (23), Treharne et al. (51), and Zanetti et al. (57). Keshishyan et al. (26) found that resistance to rifampin developed rather easily during passage in chlamydia-infected egg yolk sacs. This observation has since been confirmed in tissue culture systems (23, 51, 57). These data strongly indicate that should not be used rifampin alone for the treatment of chlamydial infections due to the potential favoring of the development of resistance.

Několik studií prokázalo, že rifampin je velmi účinný na Chlamydie trachomatis (3, 8, 11, 12, 23). Naše studie prokázala, že MIC je u rifampinu 0.0075 μg/ml a MBC je 0.01 μg/ml, což potvrdilo vysokou míru citlivosti C. trachomatis na rifampin. Avšak dlouhodobé působení rifampinu na chlamydie in vitro vedlo ke vzniku rezistence. Toto zjištění je v souladu s údaji publikovanými v těchto pracích: Keshishyan a spol (26), Jones a spol (23), Treharne a spol (51) a Zanetti a spol (57). Keshishyan a spol (26) zjistili, že rezistence na rifampin vznikla poměrně snadno během jeho aplikace ve žloutku nakaženém chlamydiemi. Tato pozorování byla od té doby potvrzena v systémech tkáňových kultivací (23, 51, 57). Tyto údaje jsou významným indikátorem toho, že rifampin by neměl být na chlamydiové infekce používán samostatně, vzhledem k možnému vzniku rezistence.

The combination of rifampin and azithromycin, however, revealed more encouraging results. Development of resistance was prevented when cells were treated with azithromycin and rifampin. Similar observations were made by Jones et al. (23), who reported that subinhibitory concentrations of erythromycin and oxytetracycline inhibited the development of resistant strains under conditions in which such resistance would otherwise have emerged. Additionally, the combination of rifampin and azithromycin proved to be more efficient than azithromycin alone, in that elimination of typical and aberrant inclusions and suppression of rRNA synthesis occurred earlier.

Kombinace rifampicinu s azithromycinem však prokázala mnohem povzbudivější výsledky. Při jejich souběžném použití bylo zamezeno vývoji rezistence. Jones a spol (23) učinili podobná zjištění a uvedli, že nižší než inhibiční dávky erythromycinu a oxytetracyclinu zamezily vývoji rezistence v podmínkách, v nichž by k ní jinak došlo. Kombinace rifampinu a azithromycinu navíc byla mnohem účinnější než samotný azithromycin a to v tom, že došlo k rychlejší eliminaci typických i atypických inkluzí a k potlačení syntézy rRNA.

Although we cannot be sure that this combination treatment is indeed effective in killing chlamydia, as discussed above for azithromycin, such a combination may prove to be more useful than azithromycin alone. Finally, we can assume that such a combination may possibly represent a new treatment strategy.

Ačkoli si nemůžeme být zcela jisti, že tato kombinovaná léčba chlamydie účinně zabije, jak jsme se zmínili výše u azithromycinu, může tato kombinace být vhodnější, než azithromycin samotný. Domníváme se tedy, že tato kombinace by mohla představovat novou léčebnou strategii.

 

 

ACKNOWLEDGMENTS

Poděkování

This study was supported by the German Ministry of Technology (grant 01VM9708/4) and by a research program of the Medical School Hannover (HiLF program).

Tento výzkum získal podporu od Německého ministerstva technologie (grant 01VM9708/4) a od výzkumného programu Medical School Hannover (HiLF program).


REFERENCES

1.

Agacfidan A, Moncada J, Schachter J. In vitro activity of azithromycin (CP-62, 993) against Chlamydia trachomatis and Chlamydia pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother. 1993;37:1746–1748. [PubMed]

2.

Beatty W L, Byrne G I, Morrison R P. Morphologic and antigenic characterization of interferon γ-mediated persistent Chlamydia trachomatis infection in vitro. Proc Natl Acad Sci USA. 1993;90:3998–4002. [PubMed]

3.

Becker Y, Zackay-Rones Z. Rifampicin—a new antitrachoma drug. Nature. 1969;222:851–853. [PubMed]

4.

Bianchi A, Scieux C, Salmeron C M, Casin I, Perol Y. Rapid determination of MICs of 15 antichlamydial agents by using an enzyme immunoassay (Chlamydiazyme). Antimicrob Agents Chemother. 1988;32:1350–1353. [PubMed]

5.

Blackman H J, Yoneda C, Dawson C R, Schachter J. Antibiotic susceptibility of Chlamydia trachomatis. Antimicrob Agents Chemother. 1977;12:673–677. [PubMed]

6.

Blythe J M, Katz B P, Batteiger B E, Ganser J A, Jones R B. Recurrent genitourinary chlamydial infections in sexually active female adolescents. J Pediatr. 1992;121:487–493. [PubMed]

7.

Børsum T, Dannevig L, Størvold G, Melby K. Chlamydia trachomatis: in vitro susceptibility of genital and ocular isolates to some quinolones, amoxillin and azithromycin. Chemotherapy (Basel). 1990;36:407–415. [PubMed]

8.

Bowie W R, Lee C K, Alexander E R. Prediction of efficacy of antimicrobial agents in treatment of infectious due to Chlamydia trachomatis. J Infect Dis. 1978;138:655–659. [PubMed]

9.

Byrne G I, Stephens R S, Ada G, Caldwell H D, Su H, et al. Workshop on in vitro neutralization of Chlamydia trachomatis: summary of proceedings. J Infect Dis. 1993;168:415–420. [PubMed]

10.

Caldwell H D, Kromhout J, Schachter J. Purification and partial characterization of the outer membrane protein of Chlamydia trachomatis. Infect Immun. 1981;31:1161–1176. [PubMed]

11.

Cevenini R, Landini M P, Donati M, Rumpianesi F. Antimicrobial drug susceptibility of 15 strains of Chlamydia trachomatis recently isolated from cases of nongonococcal urethritis in Italy. J Antimicrob Chemother. 1980;6:285–300. [PubMed]

12.

Cevenini R, Donati M, Sambri V, Rumpianesi F, LaPlaca M. Enzyme-linked immunosorbent assay for “in vitro” detection of sensitivity of Chlamydia trachomatis to antimicrobial drugs. J Antimicrob Chemother. 1987;20:677–684. [PubMed]

13.

Coles A M, Reynolds D J, Harper A, Devitt A, Pearce J H. Low-nutrient induction of abnormal chlamydial development: a novel component of chlamydial pathogenesis. FEMS Microbiol Lett. 1993;106:193–200. [PubMed]

14.

Cotter T W, Meng Q, Shen Z L, Zhang Y X, Su H, Caldwell H D. Protective efficacy of major outer membrane protein-specific immunoglobulin A (IgA) and IgG monoclonal antibodies in a murine model of Chlamydia trachomatis genital tract infection. Infect Immun. 1995;63:4704–4714. [PubMed]

15.

Dean D, Suchland R J, Stamm W E. Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping. J Infect Dis. 2000;182:909–916. [PubMed]

16.

Dreses-Werringloer U, Padubrin I, Jürgens-Saathoff B, Hudon A P, Zeidler H, Köhler L. Persistence of Chlamydia trachomatis is induced by ciprofloxacin and ofloxacin in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 2000;44:3288–3297. [PubMed]

17.

Gerard H C, Whittum-Hudson J A, Hudson A P. Genes required for assembly and function of the protein synthetic system in Chlamydia trachomatis are expressed early in elementary to reticulate body transformation. Mol Gen Genet. 1997;255:637–642. [PubMed]

18.

Gieffers J, Füllgraf H, Jahn J, Klinger M, Dalhoff K, Katus H A, Solbach W, Maass M. Chlamydia pneumoniae infection in circulating human monocytes is refractory to antibiotic treatment. Circulation. 2001;103:351–356. [PubMed]

19.

Ginsburg I, Lahav M. Lysis and biodegradation of microorganisms in infectious sites may involve cooperation between leukocyte, serum factors and bacterial wall autolysins: a working hypothesis. Eur J Clin Microbiol. 1983;2:186–191. [PubMed]

20.

Hammerschlag M R, Golden N H, Oh K, Gelling M, Sturdevant M, Brown P R, Aras Z, Neuhoff S, Dumornay W, Roblin P M. Single dose of azithromycin for the treatment of genital chlamydial infections in adolescents. J Pediatr. 1993;122:961–965. [PubMed]

21.

Hillis S D, Coles F B, Litchfield B, Black C M, Mojica B, Schmitt K, Louis M E. Doxycycline and azithromycin for prevention of chlamydial persistence or recurrence one month after treatment in women. A use-effectiveness study in public health settings. Sex Transm Dis. 1998;25:5–11. [PubMed]

22.

Ingalls R R, Rice P A, Qureshi N, Takayama K, Lin J S, Golenbock D T. The inflammatory cytokine response to Chlamydia trachomatis infection is endotoxin mediated. Infect Immun. 1995;63:3125–3130. [PubMed]

23.

Jones R B, Ridgeway G L, Boulding S, Hunley K L. In vitro activity of rifamycins alone and in combination with other antibiotics against Chlamydia trachomatis. Rev Infect Dis. 1983;5(Suppl. 3):556–561.

24.

Katz B P, Caine V A, Batteiger B E, Jones R B. A randomized trial to compare 7 and 21 day tetracycline regimens in the prevention of recurrence of infection with Chlamydia trachomatis. Sex Transm Dis. 1991;18:36–40. [PubMed]

25.

Katz, B P.;Fortenberry, D.; Orr, D. Factors affecting chlamydial persistence or recurrence one and three months after treatment. In: Stephens R S, Byrne G I, Christiansen G, et al., editors. Chlamydia infections: proceedings of the Ninth International Symposium on Human Chlamydial Infection. Berkeley, Calif: Berkeley University Press; 1998. pp. 35–38.

26.

Keshishyan H, Hanna L, Jawetz E. Emergence of rifampin-resistance in Chlamydia trachomatis. Nature. 1973;244:173–174. [PubMed]

27.

Kjær H O, Dimcevski G, Hoff G, Oleson F, Østergaard L. Recurrence of urogenital Chlamydia trachomatis infection evaluated by mailed samples obtained at home: 24 weeks' prospective follow up study. Sex Transm Infect. 2000;76:169–172. [PubMed]

28.

Köhler L, Nettelnbreker E, Hudson A P, Ott N, Gérard H C, Branigan P J, Schumacher H R, Drommer W, Zeidler H. Ultrastructural and molecular analyses of the persistence of Chlamydia trachomatis (serovar K) in human monocytes. Microb Pathog. 1997;22:133–142. [PubMed]

29.

Kramer M J, Gordon F B. Ultrastructural analysis of the effects of penicillin and chlortetracycline on the development of a genital tract Chlamydia. Infect Immun. 1971;3:333–341. [PubMed]

30.

Kutlin A, Roblin P M, Hammerschlag M R. In vitro activities of azithromycin and ofloxacin against Chlamydia pneumoniae in a continuous-infection model. Antimicrob Agents Chemother. 1999;43:2268–2272. [PubMed]

31.

Laemmli U K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227:680–685. [PubMed]

32.

Lauharanta J, Saarinen K, Mustonen M T, Happonen H P. Single-dose oral azithromycin versus seven-day doxycycline in the treatment of non-gonococcal urethritis in males. J Antimicrob Chemother. 1993;31(Suppl. E):177–183. [PubMed]

33.

Lefevre J C, Bauriaud R, Gaubert E, Escaffre M C, Lareng M B. In vitro activity of sparfloxacin and other antimicrobial agents against genital pathogens. Chemotherapy (Basel). 1992;38:303–307. [PubMed]

34.

Martin D H, Mroczkowski T F, Dalu Z A, McCarty J, Jones R B, Hopkins S J, Johnson R B. A controlled trial of a single dose of azithromycin for the treatment of chlamydial urethritis and cervicitis. N Engl J Med. 1992;327:921–925. [PubMed]

35.

Matsumoto A, Manire G P. Electron microscopic observation on the effects of penicillin on the morphology of Chlamydia psittaci. J Bacteriol. 1970;101:278–285. [PubMed]

36.

Morrison R P, Lyng K, Caldwell H D. Chlamydial disease pathogenesis. Ocular hypersensitivity elicited by a genus-specific 57-kD protein. J Exp Med. 1989;169:663–675. [PubMed]

37.

Morrison R P, Belland R J, Lyng K, Caldwell H D. Chlamydial disease pathogenesis. The 57-kD chlamydial hypersensitivity antigen is a stress response protein. J Exp Med. 1989;170:1271–1283. [PubMed]

38.

Munday P E, Thomas B J, Gilroy C B, Gilchrist C, Taylor-Robinson D. Infrequent detection of Chlamydia trachomatis in a longitudinal study of women with treated cervical infection. Genitourin Med. 1995;71:24–26. [PubMed]

39.

Nettelnbreker E, Zeidler H, Bartels H, Dreses-Werringloer U, Däubener W, Holtmann H, Köhler L. Effect of IFN-γ on persistent infection by Chlamydia trachomatis serovar K in TPA-differentiated U937 cells. J Med Microbiol. 1997;46:1–9. [PubMed]

40.

Nilsen A, Halsos A, Johansen A, Hansen E, Tørud E, Moseng D, Ånestad G, Størvold G. A double blind study of single dose azithromycin and doxycycline in the treatment of chlamydial urethritis in males. Genitourin Med. 1992;68:325–327. [PubMed]

41.

Notomi T, Ikeda Y, Nagayama A. Minimum inhibitory and minimal lethal concentration against Chlamydia trachomatis dependent on the time of addition and the duration of the presence of antibiotics. Chemotherapy (Tokyo). 1999;45:242–248. [PubMed]

42.

Nyström-Rosander, Hultén C K, Gustavsson I, Cars O, Engstrand L, Hjelm E. Susceptibility of Chlamydia pneumoniae to azithromycin and doxycycline: methodological aspects on the determination of minimal inhibitory and minimal bactericidal concentrations. Scand J Infect Dis. 1997;29:513–516. [PubMed]

43.

Ossewarde J M, Plantema F H F, Rieffe M, Nawrocki R P, de Vries A, van Loon A M. Efficacy of single-dose azithromycin versus doxycycline in the treatment of cervical infections caused by Chlamydia trachomatis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1992;11:693–697. [PubMed]

44.

Raulston J E. Response of Chlamydia trachomatis serovar E to iron restriction in vitro and evidence for iron-regulated chlamydial proteins. Infect Immun. 1997;65:4539–4547. [PubMed]

45.

Ridgeway G L, Owen J M, Oriel J D. The antimicrobial susceptibility of Chlamydia trachomatis in cell culture. Br J Vener Dis. 1978;54:103–106. [PubMed]

46.

Scieux C, Bianchi A, Chappey B, Vassias I, Perol Y. In vitro activity of azithromycin against Chlamydia trachomatis. J Antimicrob Chemother. 1990;25(Suppl. A):7–10. [PubMed]

47.

Shemer Y, Sarov I. Inhibition of growth of Chlamydia trachomatis by human gamma interferon. Infect Immun. 1985;48:592–596. [PubMed]

48.

Slaney L, Chubb H, Ronald A, Brunham R. In vitro activity of azithromycin, erythromycin, ciprofloxacin and norfloxacin against Neisseria ghonorrhoea, Haemophilus ducreyi and Chlamydia trachomatis. J Antimicrob Chemother. 1990;25(Suppl. A):1–5. [PubMed]

49.

Steingrimsson O, Olafsson J H, Thorarinsson H, Ryan R W, Johnson R B, Tilton R C. Azithromycin in the treatment of sexually transmitted disease. J Antimicrob Chemother. 1990;25(Suppl. A):109–114. [PubMed]

50.

Su H, Watkins N G, Zhang Y X, Caldwell H D. Chlamydia trachomatis-host cell interactions: role of the chlamydial major outer membrane protein as an adhesin. Infect Immun. 1990;58:1017–1025. [PubMed]

51.

Treharne J D, Yearsley P J, Ballard R C. In vitro studies of Chlamydia trachomatis susceptibility and resistance to rifampin and rifabutin. Antimicrob Agents Chemother. 1989;33:1394.

52.

Walsh M, Kappus E W, Quinn T C. In vitro evaluation of C-62,933, erythromycin, clindamycin, and tetracycline against Chlamydia trachomatis. Antimicrob Agents Chemother. 1987;31:811–812. [PubMed]

53.

Welsh L, Gaydos C A, Qinn T C. In vitro evaluation of activities of azithromycin, erythromycin, and tetracycline against Chlamydia trachomatis and Chlamydia pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother. 1992;36:291–294. [PubMed]

54.

Wyrick P B, Davis C H, Knight S T, Choong J. In vitro activity of azithromycin on Chlamydia trachomatis infected, polarized human endometrial epithelial cells. J Antimicrob Chemother. 1993;31:139–150. [PubMed]

55.

Wyrick P B, Knight S T, Paul T R, Rank R G, Barbier C S. Persistent chlamydial envelope antigens in antibiotic-exposed infected cells trigger neutrophil chemotaxix. J Infect Dis. 1999;179:954–966. [PubMed]

56.

Xu F, Schillinger J A, Markowitz L E, Sternberg M R, Aubin M R, St Louis M E. Repeat Chlamydia trachomatis infection in women: analysis through a surveillance case registry in Washington State, 1993–1998. Am J Epidemiol. 2000;152:1164–1170. [PubMed]

57.

Zanetti S, Usai D, Nonis A, Fadda G. In vitro activity of 3-azinomethyl-rifamycin (SPA-S-565) against Chlamydia trachomatis. J Antimicrob Chemother. 1996;37:357–359. [PubMed]

58.

Zhang Y S, Stewart S, Joseph T, Taylor H R, Caldwell H D. Protective monoclonal antibodies recognize epitopes located on the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis. J Immunol. 1987;138:575–581. [PubMed]

59.

Zvillich M, Sarov I. The persistence of Chlamydia trachomatis elementary body cell walls in human polymorphonuclear leucocytes and induction of a chemiluminescent response. J Gen Microbiol. 1989;135:95–104. [PubMed]

 

Articles from Antimicrobial Agents and Chemotherapy are provided here courtesy of
American Society for Microbiology (ASM)


Perfektní, adriano. Kdo

Perfektní, adriano. Kdo jde první ke Klubalovi, tak mu to prosím vemte:-))

Radka - syn Tomáš, 6 let, růstová retardace, chlamydie, EBV, candida.

Radka - syn Tomáš, 7 let, růstová retardace, chlamydie, EBV, candida.

Prosim vas, jeste ne!!

Prosim vas, jeste ne!! Jeste se to bude editovat. Chybi tam obrazky a je to cele rozhazene. Online je to kvuli Michalovi, aby mohl pomoci s formatovanim. Pak dam vedet. Jinak muzete podekovat uzivateli Matosa.

Na Wheldonove protokolu od 02/2006 pro Cpn a Mycoplasmata, unavovy syndrom, fibromyalgii, bolesti kloubu, intestinalni potize a milion dalsich problemu..

Na Wheldonove/Strattonove protokolu od 02/2006 do 10/2011 pro tezky unavovy syndrom, fibromyalgii, bolesti kloubu, intestinalni potize a milion dalsich problemu..

Klubalovi to vezmu

Klubalovi to vezmu samozřejmě v originále. 

Matoso, díky moc.

Radka - syn Tomáš, 6 let, růstová retardace, chlamydie, EBV, candida.

Radka - syn Tomáš, 7 let, růstová retardace, chlamydie, EBV, candida.

Bude to určitě také v

Bude to určitě také v příručce k léčbě, že? ještě to tam nevidím... (WP od 1.6.08.)Je mi 49r.Od dětství opak. infekty HCD, DCD, záněty. Nyní-teploty, únava, záněty, migrény, kolapsy, kašel, reakt.EBV, Ch.pn.,Ch.tr.- bolesti všech kloubů a celého těla, ztuhlost, otoky, křeče DK, zhorš.pamět, bolavé oči atd.
(WP od 1.6.08.)53r.od dětství opak.infekty HCD, DCD,záněty.Dále-teploty,únava,záněty,migrény,kolapsy,kašel, reakt.EBV, Ch.pn.,Ch.tr.- bolesti všech kloubů-celé tělo,ztuhlost, otoky uzlin-třísel,křeče DK,zhorš.pamět,bolavé oči,mozková mlha atd.)

"...Pro chlamydiové

"...Pro chlamydiové infekce však experimentální prostředí in vitro plně neodpovídá situaci in vivo, protože zjištění MIC se provádí po přidání antibiotik brzy po infekci buněčné kultury nebo dokonce současně s infekcí. Některé studie ukázaly navýšení MIC, když jsou antibiotika podána 24 hodin po nákaze (41, 42)..."

 

"....Vývoj infekce v buňkách HEp-2 léčených azithromycinem byl charakterizován třemi rozdílnými fázemi. V první fázi byly přítomny nakažlivé chlamydie a typické inkluze. Avšak další nasazení azithromycinu potlačilo vývoj infekčních bakterií a po 8 a 10 dnech vedlo k vývoji stavu, v němž jsou kultivačně negativní. Syntéza rRNA byla zjistitelná po významně delší dobu než infekční organismy. To znamená, že chlamydie byly dočasně uvězněny v nemetabolizujícím, avšak životaschopném stavu..."

"... Nedávno jsme byli schopni demonstrovat, že ciprofloxacin a ofloxacin nejenže nedokázaly chlamydie vyhubit z hostitelských buněk, ale navíc vyvolaly persistentní infekci, třebaže jsou obě antibiotika účinná při testech citlivosti (16)..."

"...Životaschopnost chlamydií během podávání azithromycinu. Několik studií in vitro prokázalo, že zastavení nebo změnu typického životního cyklu lze navodit pomocí gamma interferonu (IFN-γ) penicillinu, ciprofloxacinu, ofloxacinu, nebo vyčerpáním základních aminokyselin, což vede ke stavu, v němž jsou chlamydie při kultivaci negativní, avšak životaschopné (2, 13, 16, 29, 35). To znamená, že kultivační negativita nemusí vždy znamenat, že v těle nejsou životaschopné bakterie..."

 

atd. Zajímavý ja také ten gamma interferon (IFN-γ)

 

Jan Na WP od 12/2005 pro Cpn; CFS, fibromyalgie, vysoký tlak, závratě, opakované infekty HCD i DCD, uší, VAS, parestézie a bolesti DK, průjmy, křeče a zažívací potíže ... srpen 2008 zlepšení ve všem i tam, kde údajně nebyla šance.

březen 2013 ukončení CAPu 

Volby prohlížení komentářů

Vyberte si, jak chcete zobrazovat komentáře a klikněte na "Uložit změny".

Powered by Drupal - Modified by Danger4k